Hemoglobinelektroforesexperiment

Experimentprincip

Hemoglobinelektrofores syftar till att upptäcka och bekräfta olika normala och onormala hemoglobiner.

På grund av olika laddningar och isoelektriska punkter av olika hemoglobintyper, i en viss pH-buffertlösning, när den isoelektriska punkten för hemoglobin är lägre än pH-värdet för buffertlösningen, bär hemoglobinet en negativ laddning och migrerar mot anoden under elektrofores. Omvänt rör sig hemoglobin med en positiv laddning mot katoden.

Under en viss spänning och efter en specifik elektroforestid uppvisar hemoglobiner med olika laddningar och molekylvikter olika migrationsriktningar och -hastigheter. Detta möjliggör separation av distinkta zoner, och efterföljande kolorimetrisk eller elektroforetisk skanningsanalys kan utföras på dessa zoner för att kvantifiera olika hemoglobiner. Den mest använda metoden är pH 8,6 cellulosaacetatmembranelektrofores.

Inom cytoplasman oxideras etylenglykolgrupper (CHOH-CHOH) som finns i glykogen eller polysackaridämnen (såsom mukopolysackarider, mukoproteiner, glykoproteiner, glykolipider etc.) av perjodsyra och omvandlas till aldehydgrupper (CHO-CHO). Dessa aldehydgrupper kombineras med det färglösa lila-röda Schiff-reagenset och bildar ett lila-rött färgämne som avsätts där polysackarider finns i cellen. Denna reaktion är känd som periodic acid-Schiff (PAS)-färgning, tidigare kallad glykogenfärgning.

Experimentmetod

Material:Cellulosaacetatmembran, elektroforesapparater(DYCP-38C och nätaggregat DYY-6C ), Superior Sample Loading Tool(pipett), spektrofotometer, kolorimetriska kyvetter, buffertar.

Buffert:

(1) pH 8,6 TEB-buffert: Väg upp 10,29 g Tris, 0,6 g EDTA, 3,2 g borsyra och tillsätt destillerat vatten till 1000 ml.

(2) Boratbuffert: Väg 6,87 g borax och 5,56 g borsyra och tillsätt destillerat vatten till 1000 ml.

Förfarande:

Preparation av hemoglobinlösning

Ta 3 ml blod som innehåller heparin eller natriumcitrat som antikoagulant. Centrifugera vid 2000 rpm i 10 minuter och kassera plasman. Tvätta de röda blodkropparna tre gånger med fysiologisk koksaltlösning (750 rpm, 5 minuters centrifugering varje gång). Centrifugera vid 2200 rpm i 10 minuter och kassera supernatanten. Tillsätt lika mycket destillerat vatten och tillsätt sedan 0,5 gånger volymen koltetraklorid. Skaka kraftigt i 5 minuter och centrifugera sedan vid 2200 rpm i 10 minuter för att samla upp den övre Hb-lösningen för senare användning.

Blötläggning av membranet

Skär cellulosaacetatmembranet i remsor som mäter 3 cm × 8 cm. Blötlägg dem i pH 8,6 TEB-buffert tills de är helt mättade, ta sedan bort och torka av med filterpapper.

Spotting

Använd en pipett för att upptäcka 10 μl av hemoglobinlösningen vertikalt på cellulosaacetatmembranet (den grova sidan), cirka 1,5 cm från kanten.

Elektrofores

Häll boratbuffertlösningen i elektroforeskammaren. Placera cellulosaacetatmembranet med den prickiga sidan vid katodänden av kammaren. Kör på 200 V i 30 minuter.

Eluering

Klipp ut HbA- och HbA2-zonerna, placera dem i separata provrör och tillsätt 15 ml respektive 3 ml destillerat vatten. Skaka försiktigt för att eluera hemoglobinet helt och blanda sedan.

Kolorimetri

Nollställ absorbansen med destillerat vatten för elueringslösningen och mät absorbansen vid 415 nm.

Beräkning

HbA2(%) = Absorbans av HbA2-rör / (Absorbans av HbA-rör × 5 + Absorbans av HbA2-rör) × 100 %

Experimentell resultatberäkning

Referensintervall för pH 8,6 TEB-buffertcellulosaacetatelektrofores: HbA > 95 %, HbA2 1 %-3,1 %

Anteckningar

Elektroforestiden bör inte vara för lång. Cellulosaacetatmembranet bör inte torka ut under elektrofores. Stoppa elektrofores när HbA och HbA2 är tydligt separerade. Långvarig elektrofores kan orsaka banddiffusion och suddighet.

Undvik att använda för mycket prov. För mycket hemoglobinvätska kan leda till att band lossnar eller otillräcklig färgning, vilket resulterar i falskt förhöjda HbA-nivåer.

Förhindra kontaminering av cellulosaacetatmembranet med proteiner.

Strömmen bör inte vara för hög; annars kan hemoglobinband inte separeras.

Inkludera alltid prover från normala individer och nödvändiga kända onormala hemoglobiner som kontroller.

Beijing Liuyi Biotechnology tillverkar den professionella elektroforestanken för hemoglobinelektrofores som är modellenDYCP-38Ccellulosaacetatmembranelektroforestank, och det finns två modeller av elektroforesströmförsörjning tillgängliga för cellulosaacetatmembranelektroforestankenDYY-2CochDYY-6Cströmförsörjning.

Samtidigt tillhandahåller Beijing Liuyi Biotechnology cellulosaacetatmembran för kunder, och storleken på cellulosaacetatmembran kan anpassas. Välkommen att fråga oss om prover och mer information.

Beijing Liuyi varumärke har mer än 50-årig historia i Kina och företaget kan tillhandahålla stabila och högkvalitativa produkter över hela världen. Genom år av utveckling är det värt ditt val!

Vi söker nu partners, både OEM elektroforestank och distributörer är välkomna.

Om du har någon inköpsplan för våra produkter, tveka inte att kontakta oss. Du kan skicka ett meddelande till oss på e-post[e-postskyddad]eller[e-postskyddad], eller ring oss på +86 15810650221 eller lägg till Whatsapp +86 15810650221, eller Wechat: 15810650221